聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
深扒PCR实验的失败原因及解决办法
日常实验中，PCR已经可谓无孔不入了，实验大家可能都会做，但是会做和做好还是有很大区别的。今天跟着我们来看看在做PCR实验过程中可能遇到的问题。
首先说说什么是PCR呢？
想要做好PCR实验我们需要准备哪些东西
DNA 模板
与特定 DNA 模板结合的引物
去离子水
商业化的 DNA 聚合酶以及缓冲液
dNTP
MgSO4（可选）
DMSO（可选）
我们在做实验的过程中常见问题有哪些呢？
以下绝对是干货！！！
无扩增条带
-
酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
-
模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。
-
变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
-
反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95 ℃ 加热 5~10 分钟。
-
引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
-
引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
-
DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。
PCR 产物量过少
-
退火温度不合适。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
-
DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
-
PCR 循环数不足。增加反应循环数。
-
引物量不足。增加体系中引物含量。
-
延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
-
变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。
-
DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。
扩增产物在凝胶呈弥散状
-
酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
-
dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。
-
MgCl2 浓度过高。可适当降低其用量。
-
模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。
-
引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
-
循环次数过多。增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用两种温度的 PCR 循环。
-
退火温度过低。
-
电泳体系有问题：
① 凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
② 凝胶没有凝固好；
③ 琼脂糖质量差。
-
若为 PCR 试剂盒则可能：
① 由于运输储存不当引起试剂盒失效；
② 试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
-
降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
扩增产物出现多条带（杂带）
-
引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
-
循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
-
酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
-
退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
-
样品处理不当。
-
Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。
-
若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
-
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
-
反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
-
引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
-
引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
-
模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。
-
外源 DNA 污染。确保操作的洁净。
阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
条带大小与理论不符
-
污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
-
模板或引物使用错误。更换引物和模板。
-
基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。
怎么样，是不是获益良多呢。知道了出现问题的原因，在后续的实验中就可以做到有的放矢啦，不会一出现问题就两眼一抹黑，而且在做实验之前就可以尽量避免这些问题的出现，提高效率和实验的成功率比什么都强。
把时间留给思考，把实验留给我们，如果您时间紧迫又对自己实验信心不足，可以试着把实验外包给专业的技术服务公司，成都百纳特生物值得您的信赖，专业技术服务老牌公司，把实验外包给我们，一定错不了。
技术服务电话：028-85099472
